Gene PsALG8 entra no foco da resistência ao metalaxil

Pesquisadores chineses identificaram o gene PsALG8 como candidato ligado à sensibilidade ao metalaxil e ao crescimento micelial em Phytophthora sojae, oomiceto associado à podridão-radicular e da haste da soja. O estudo usou evolução experimental, ressequenciamento genômico e edição gênica por CRISPR/Cas9 para investigar mecanismos de resistência ao fungicida (DOI 10.3390/jof12070479).

O trabalho gerou seis mutantes resistentes ao metalaxil a partir do isolado parental P7076, sensível ao produto. Os mutantes receberam as denominações PSM7-1, PSM7-2, PSM7-3, PSM7-4, PSM7-5 e PSM7-6. Eles surgiram após 30 repicagens sucessivas em meio com metalaxil. Os valores de EC50 variaram de 324,57 microgramas por mililitro a 1.545,83 microgramas por mililitro. Todos apresentaram fator de resistência superior a 2.000.

O isolado parental P7076 apresentou EC50 de 0,12 micrograma por mililitro. O resultado confirmou sua sensibilidade ao metalaxil. Em placas com 0,2, 0,6, 500 e 1.000 microgramas por mililitro do fungicida, o crescimento micelial de P7076 sofreu forte redução. Os seis mutantes mantiveram crescimento superior, inclusive nas maiores doses testadas.

Manejo de oomicetos

O metalaxil integra o grupo das fenilamidas. O produto tem uso amplo no manejo de oomicetos, incluindo espécies de Phytophthora, Pythium e míldios. O estudo destaca o risco intrínseco de resistência associado ao produto. Também lembra relatos de resistência em outros oomicetos, como Phytophthora infestans, Plasmopara viticola e espécies de Pythium. Para Phytophthora sojae, os pesquisadores afirmam não haver registro de isolados resistentes em populações naturais até o momento.

A equipe aplicou ressequenciamento de genoma completo nos seis mutantes resistentes. A análise gerou 29,11 gigabases de dados pareados. Após a filtragem, cerca de 28,17 gigabases de leituras de alta qualidade foram alinhadas ao genoma de referência de Phytophthora sojae. A profundidade de sequenciamento variou de 47,31 vezes a 59,87 vezes.

A comparação entre os mutantes e o isolado parental revelou 4.242 polimorfismos de nucleotídeo único. Entre eles, 29,35 por cento ocorreram em regiões codificadoras, 7,38 por cento em íntrons e 63,27 por cento em regiões intergênicas. A análise detectou 619 mutações sinônimas e 651 mutações não sinônimas em sequências codificadoras.

Genes filtrados

Os pesquisadores filtraram genes com substituições de aminoácidos. A lista chegou a 324 genes candidatos. Entre eles, 69 apresentaram mutações pontuais consistentes nos seis mutantes resistentes. A anotação por Gene Ontology indicou genes ligados a componentes celulares, função molecular e processos biológicos. As categorias incluíram membrana, atividade catalítica, ligação, processo metabólico, processo celular e atividade transportadora.

O gene EGZ16653 chamou a atenção. Ele apresentou a mutação pontual G1264C com maior frequência em homozigose entre os mutantes. A mutação apareceu em todos os isolados resistentes. Ela ocorreu em homozigose em PSM7-1, PSM7-2, PSM7-3 e PSM7-4. Em PSM7-5 e PSM7-6, surgiu em heterozigose.

O gene recebeu o nome PsALG8. Ele codifica uma proteína prevista como alfa-1,3-glucosiltransferase. A proteína possui 575 aminoácidos. A mutação G1264C provoca a substituição V422L. Essa troca ocorre no domínio Alg6_Alg8, próximo ao nono segmento transmembrana. A proteína prevista contém dez domínios transmembrana.

A comparação com sequências de 29 isolados de campo de Phytophthora sojae, seis mutantes resistentes e 15 outras espécies de oomicetos indicou conservação da valina na posição 422. Segundo os pesquisadores, a substituição V422L não apareceu naturalmente nos oomicetos avaliados. O dado sustenta a associação entre PsALG8 e resistência induzida em laboratório.

A equipe também avaliou genes ligados à RNA polimerase I. Estudos anteriores associaram mutações na maior subunidade dessa enzima, RPA190, à insensibilidade ao metalaxil em Phytophthora infestans. No novo trabalho, os seis mutantes de Phytophthora sojae não apresentaram mutações não sinônimas em subunidades de RNA polimerase I. Os pesquisadores concluem, com cautela, que mutações codificadoras nessas subunidades não explicam a resistência observada nos mutantes analisados.

Validação funcional

A validação funcional usou CRISPR/Cas9 para nocaute de PsALG8. Os pesquisadores geraram nocautes no isolado sensível P7076 e no mutante resistente PSM7-3. As linhagens TP-6 e TP-13 derivaram do fundo genético sensível. As linhagens TM-5 e TM-6 derivaram do fundo resistente.

A perda de PsALG8 aumentou a sensibilidade ao metalaxil. Em P7076, as linhagens TP-6 e TP-13 sofreram inibição maior do crescimento micelial em 0,02, 0,05, 0,10 e 0,20 micrograma por mililitro do fungicida. Em PSM7-3, as linhagens TM-5 e TM-6 também apresentaram maior inibição nas concentrações testadas, em comparação com o parental resistente.

O nocaute também reduziu o crescimento micelial em meio sem metalaxil. Após sete dias a 25 graus Celsius, P7076 e controles não editados apresentaram diâmetro médio de colônia de 4,03 centímetros. As linhagens TP-6 e TP-13 atingiram cerca de 3,51 centímetros. No fundo resistente, PSM7-3 e controles chegaram a 4,05 centímetros. As linhagens TM-5 e TM-6 alcançaram 3,62 centímetros.

Os resultados indicam participação de PsALG8 na tolerância ao metalaxil e no crescimento micelial de Phytophthora sojae em condições de laboratório. Os pesquisadores ressaltam, porém, que os dados não comprovam a substituição V422L como causa isolada da resistência. Eles apontam a necessidade de complementação, substituição alélica, controles de repicagem sem seleção e monitoramento de populações de campo.

O estudo sugere risco alto de desenvolvimento de resistência ao metalaxil em Phytophthora sojae sob pressão de seleção. Os pesquisadores recomendam combinações e rotações com outros oomiceticidas para manejo da doença. Também indicam PsALG8 e outros genes candidatos como alvos para investigações futuras sobre resistência a fungicidas em oomicetos.