RNAi atua contra actina muscular para controle de tripes

Pesquisadores desenvolveram um sistema bacteriano capaz de elevar em cerca de onze vezes a produção de RNA de fita dupla, molécula usada em estratégias de interferência por RNA contra pragas agrícolas. A equipe testou o material em duas espécies de tripes, Megalurothrips usitatus e Frankliniella occidentalis, e registrou mortalidade de adultos após ingestão de dsRNA direcionado ao gene da actina muscular. O estudo também indicou duas possíveis rotas celulares envolvidas na absorção da molécula: endocitose mediada por clatrina e transporte por proteínas semelhantes a SID-1 (DOI 10.3390/insects17070685).

O trabalho avaliou alternativa molecular ao uso de inseticidas químicos no manejo de tripes. Esses insetos causam danos diretos às plantas por alimentação e também atuam como vetores de vírus. O controle depende de inseticidas em muitos sistemas produtivos, mas o uso frequente favorece resistência.

Silenciamento de genes

A interferência por RNA, ou RNAi, silencia genes específicos por meio de dsRNA complementar ao RNA mensageiro alvo. A aplicação dessa tecnologia exige produção de dsRNA em escala e entendimento sobre a entrada da molécula nas células dos insetos. Segundo o estudo, esses dois pontos ainda limitam aplicações contra tripes.

A equipe construiu vetores baseados em pET28a para expressão de dsRNA em Escherichia coli HT115(DE3). Os pesquisadores compararam três configurações: sem terminador, com um terminador T7 e com três terminadores em tandem. O vetor com três terminadores combinou tT7, rrnB T1 e tT7 em cada lado da região de expressão.

O sistema com três terminadores elevou a produção de dsRNA em 11,37 vezes em relação ao vetor sem terminador. A eletroforese em gel confirmou a síntese do dsRNA de 400 pares de bases. O crescimento bacteriano caiu no grupo com três terminadores após a indução, mas o rendimento por célula aumentou.

Com esse sistema, os pesquisadores produziram dsRNA contra uma região conservada do gene da actina muscular. O fragmento escolhido apresentou identidade superior a 97% entre Megalurothrips usitatus e Frankliniella occidentalis. A escolha buscou um alvo comum para espécies de tripes presentes em infestações mistas.

Dieta artificial

Os ensaios usaram dieta artificial com sacarose e pólen de pinus entre camadas de Parafilm. Os adultos ingeriram dsRNA por alimentação em membrana. A ingestão recebeu confirmação com dsRNA marcado com Cy3. A fluorescência apareceu no trato digestivo dos insetos tratados, enquanto os controles sem marcação não apresentaram sinal.

A mortalidade aumentou com a concentração de dsRNA. Após setenta e duas horas, a dose de 1500 nanogramas por microlitro causou mortalidade média de 72,2% em Megalurothrips usitatus. Em Frankliniella occidentalis, a mortalidade média chegou a 47,8% na mesma dose. Os controles com dseGFP e água mantiveram baixa mortalidade.

Expressão do gene

A expressão do gene alvo também caiu. Em Megalurothrips usitatus, o dsRNA reduziu os transcritos de actina muscular em 26,0% após quarenta e oito horas e em 33,1% após setenta e duas horas. Em Frankliniella occidentalis, a redução alcançou 39,6% após setenta e duas horas.

A equipe analisou o transcriptoma de Megalurothrips usitatus após alimentação com 300 nanogramas por microlitro de dsactin, dseGFP ou água. A dose subletal permitiu observar respostas de expressão gênica com menor interferência de efeitos ligados à morte dos insetos.

Agrupamento distinto

A análise de RNA-seq mostrou agrupamento distinto entre os tratamentos. Em comparação com dseGFP, o tratamento com dsactin resultou em 86 genes regulados para baixo e 63 genes regulados para cima. Em comparação com água, o dsactin resultou em 1829 genes regulados para baixo e 695 genes regulados para cima.

As vias enriquecidas incluíram digestão e absorção de proteínas, lisossomo e endocitose. Genes ligados à endocitose mediada por clatrina, como cadeia pesada de clatrina, cadeia leve de clatrina, adaptador AP-2 e Hsc70, tiveram maior expressão após exposição a dsRNA. O mesmo ocorreu com transcritos semelhantes a SID-1.

Duas rotas

Os pesquisadores propõem um modelo com duas rotas potenciais de entrada do dsRNA em Megalurothrips usitatus. Uma rota envolve vesículas formadas por clatrina. A outra envolve transporte transmembrana associado a proteínas semelhantes a SID-1. O estudo trata essa segunda participação como hipótese e aponta necessidade de validação experimental.

A validação por RT-qPCR confirmou a consistência dos dados de RNA-seq. Doze genes selecionados apresentaram padrões semelhantes entre os dois métodos. A correlação entre os resultados chegou a R = 0,8435, com valor de p inferior a 0,0001.

Os resultados sustentam a actina muscular como alvo promissor para RNAi em tripes. A conservação da sequência permite imaginar um ingrediente ativo com ação sobre mais de uma espécie. O próprio estudo ressalta a necessidade de testar outras espécies de Thysanoptera e avaliar efeitos fora do alvo em inimigos naturais, polinizadores e outros artrópodes não alvo.

O trabalho também indica caminhos para formulações. Como dsRNA livre sofre degradação por radiação ultravioleta e nucleases, os pesquisadores citam a importância de carreadores capazes de proteger a molécula e facilitar a entrada celular. O estudo menciona polímeros em estrela, lipossomos e hidróxidos duplos lamelares como possibilidades para investigação futura.